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不同品牌游離核酸保存管的比較
點擊次數:3517 發布日期:2018-8-31  來源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負

1.前言

循環游離核酸(circulating cell-free nucleic acids)是指存在于人體循環系統中,游離于細胞外的微量內源性或外源性核酸片段,包括核DNA、線粒體DNA(mitochondrial DNA,mitDNA)、病毒DNA、信使RNA(messenger RNA, mRNA)及微小RNA(microRNA, miRNA)等。 1948年, Mandel等[1] 首次發現了血液循環中游離DNA的存在。隨后,循環游離核酸在病理狀態下的特異性變化引起了廣泛關注。雖然這一發現十分重大,但當時并未引起人們的廣泛關注,并且在此后的很長一段時間里,人們也僅局限于研究游離 DNA 與人類自身免疫病之間的關系。 1975 年, Steinman 在健康人的血漿中也發現有游離形式的核酸存在,這提示我們這種核酸的出現屬于病理學事件,而非病因學事件,但健康人血漿中游離 DNA 的量要顯著低于患有一定疾病的人。 1977年, Leon等[2] 發現腫瘤患者血清中的游離DNA水平較健康人群明顯升高,并與腫瘤的進展與預后相關。 1997年,人們發現在孕婦血漿中含有游離形式的胎兒源的 DNA,這使得血漿游離核酸的研究在胎兒出生前診斷方面的應用也有了快速的發展。 1989年, Stroun等[3] 發現腫瘤患者血液中的游離核酸含有與腫瘤細胞相同的基因突變。現如今,游離核酸與腫瘤、妊娠相關性疾病、自身免疫病、移植排斥反應、創傷、急救醫學等有著密切關系,其檢測對疾病的早期診斷、分期、監測、預后判斷等有重要意義。

鑒于游離核酸的重要檢測意義,游離核酸的保存條件則直接決定了檢測結果的可靠性。為確保游離核酸標本檢測的準確性, 本文采用了市面上常用的不同品牌游離核酸保存管,就保存效果進行了比較。

2 材料與方法

2. 1 材料

2.1.1 保存管及分組
(1) E 組:普通抗凝采血管(主要成分 EDTA·2Na);
(2) S 組: Cell-Free DNA BCT(品牌: S 公司, REF.2***52);
(3) B 組: Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌:百泰克, REF. ST2001);
(4) K 組: Cell-Free DNA Storage Tube 10mL(品牌: K 公司, Cat. CW***6S)。2.1.2 血液樣本
健康人血 10ml。

2.1.3 試劑及設備
(1) Premix EX Taq (TaKaRa,Cat.RR390A);
(2)探針及引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;
(3) Qubit dsDNA HS Assay Kit(Invitrogen by Thermo Fisher Scientific);
(4) Beta-actin 質粒由上海捷瑞生物工程有限公司合成;
(5) BioRad-CFX96(BIO-RAD, Foster city, California, USA), Qubit 2.0 Fluorometer (Life Technologies, USA), Mili-Q Advantage A10, SHZ-82A 恒溫振蕩器(常州醫療器件廠) 。

2.2 方法

2.2.1 血液樣本采集
采用標準靜脈穿刺采集年齡 22-40 歲健康人血 10ml,各組年齡差異無統計學意義(P<0.05) ,分別裝于采血管及保存管。

2.2.2 血漿分離方法
輕柔上下顛倒混勻 10 次, 800×g, 20min,轉移上層血漿至 1.5ml 離心管; 16,000×g,室溫, 10min,轉移上層血漿至 1.5ml 離心管凍存-80℃備用。提取游離核酸前,室溫解凍,16,000×g, 5min,吸取上層血漿,進行游離核酸提取。

2.2.3 游離核酸提取方法
根據 QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook 試劑盒操作說明操作。

2.2.4 Qubit 熒光計定量血漿游離 DNA 的濃度
采用 Qubit 2.0 熒光計定量血漿游離 DNA 的濃度。

2.2.5 Beta-actin 拷貝數的檢測
Beta-actin 10 倍梯度稀釋 107-101,引物分別分 actin-F1, actin-R1,探針為 probe actin,引物及探針工作濃度為 5 uM, 20ul 熒光定量體系引物加入量為各 1ul。擴增程序為 50° C、 5min, 95° C、 10min,循環 50 次, 95° C、 20s, 65° C、 20s,72° C、 10min, 結束。

擴增程序試劑組成:
Reagent         體積(ul)
Takara Premix      10
Primer F         1
Primer R         1
Probe           1
模板           1
ddH2O          補足 20ul

3 結果

3.1 不同天數下(25°C)游離核酸保存效果的對比

分別用 3 種不同的保存管(E、 S 及 B)采集血液 10ml,顛倒混勻 15 次后立即等分 4份至無抗凝劑無促凝劑的玻璃采血管中,保存條件為 25°C。分別于保存第 0、 3、 7、 14 天時分離血漿,提取游離核酸。

圖 1 顯示: 保存第 7 天和第 14 天, E 組出現明顯的溶血現象,并隨時間的延長更加嚴重;S 品牌產品保存的血液第 7 天略微有溶血現象,第 14 天時,溶血嚴重。相比之下, B 品牌產品效果較佳。

圖2 顯示: 25°C條件下, E產品在第0天時,基因組基本無釋放; 第3、 7、 14天的核酸量隨時間延長,基因組釋放量增加明顯; 第14天的核酸檢測量是第0天的至少2500倍。 B產品的保存效果在14天之內,基本能夠抑制基因組的釋放; 第14天的檢測結果為第0天的1.77倍。 S品牌產品7天之內,能夠保持cfDNA穩定,基本無基因組釋放;但第14天檢測量劇增,是第0天的2200倍。

圖 3 顯示: Beta-actin 絕對定量結果趨勢與 Qubit 結果基本一致,室溫 25°C 保存 3 天, 3 種保存管的差異不顯著;保存第 7 天時, E 與 B 組間的 P Value<0.01, 差異極顯著, B 與 S 組 0.01

圖 4Qubit 結果顯示: 三種保存管 7 天內保存效果無明顯差異, 14 天時, K 組與 S 組保存管均出現明顯的上升,分別是第 0 天的 15.27 倍和 10.21 倍, 21 天時,上升最為明顯,分別是第 0天的 22.46 倍和 13.84 倍。 B 組?;ぜ簾4嫻難涸詰?0、 3、 7、 14、 21、 28 天檢測時, 每毫升血液 cf-DNA 濃度均無明顯的上升。

圖 5Beta-actin 絕對定量結果與圖 4 基本一致。 B2 組?;ぜ簾4嫻難涸詰?0、 3、 7、 14、21、 28 天檢測時, 每毫升血液 Beta-actin 拷貝數均無明顯的上升。

3.2 不同天數下(4°C)游離核酸保存效果的對比

圖 6Qubit 結果顯示: 在 4°C 情況下, 三種保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA 濃度并無明顯的差異。

圖 7Beta-actin 結果顯示:在 4°C 情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數并無明顯的差異。

3.3 不同天數下(37°C)游離核酸保存效果的對比

圖 8Qubit 結果顯示:在 37°C 情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA 濃度并無明顯的差異。

圖 9Beta-actin 結果顯示:在 37°C 情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin拷貝數并無明顯的差異。

3.4 運輸環境(25°C)對游離核酸保存效果的影響

考慮到保存管有可能應用于樣品的長途或短途運輸,因此需用搖床模擬運輸環境對?;ぜ烈種葡赴屏訓撓跋?。 S 組、 K 組及 B 組分別采集血液一份,搖床設置 180rpm, 25°C,分別在 0、 3、 7、 14 天檢測核酸濃度和 beta-actin 拷貝量。

圖 10Qubit 結果顯示:在 25°C 模擬震蕩情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 cf-DNA濃度并無明顯的差異。

圖 11Beta-actin 結果顯示:在 25°C 模擬震蕩情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液Beta-actin 拷貝數并無明顯的差異。

4.討論

(1)從每毫升血液 Beta-actin拷貝數及每毫升血液 cf-DNA濃度兩個方面來驗證 cf-DNA完整性,已在多篇文獻中[4][5]得到驗證。
(2) 室溫 25°C 下,保存 3 天時, 3 種保存管的差異不顯著;保存第 7 天時, E 與 B 組間的差異極顯著, B 與 S 組差異具有顯著性;保存第 14 天時, B 與 S 組 P value<0.01,差異極顯著。 在室溫 25°C 下, B 組較 S 組及 E 組,保存時間較長,效果較佳。
(3)室溫 25°C 下,三種保存管 7 天內保存效果無明顯差異, 14 天時, K 組與 S 組保存管均出現明顯的上升,, 21 天時,上升最明顯。 B 組?;ぜ簾4嫻難涸詰?0、 3、 7、 14、 21、 28 天檢測時,每毫升血液 cf-DNA 濃度均無明顯的上升。 在室溫 25°C 下, B 組較 S 組及 K 組,保存時間較長,效果較佳。
(4)在 4°C 情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數及每毫升血液 cf-DNA濃度并無明顯的差異。 在 4°C 下, B 組、 S 組及 K 組,保存效果無明顯差異。
(5)在 37°C 情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數及每毫升血液 cf-DNA濃度并無明顯的差異。 在 37°C 下, B 組、 S 組及 K 組,保存效果無明顯差異。
(6) 在 25°C 模擬震蕩情況下,三種保存管 0-14 天的每毫升血液 Beta-actin 拷貝數及每毫升血液cf-DNA 濃度并無明顯的差異。 在 25°C 模擬震蕩情況下, B 組、 S 組及 K 組,保存效果無明顯差異。

5.參考文獻

[1]MANDEL P, MéTAIS P. Les acides nucléiques du plasma sanguin chez l’homme [J] . C R Acad Sci Paris, 1948,142: 241-243.
[2]LEON S A, SHAPIRO B, SKLAROFF D M, et al. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy [J] .Cancer Res, 1977, 37(3): 646-750.
[3]STROUN M, ANKER P, MAURICE P, et al. Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients[J] . Oncology, 1989, 46(5): 318-322.
[4]Norton S E, Lechner J M, Williams T, et al. A stabilizing reagent prevents cell-free DNA contamination by cellular DNA in plasma during blood sample storage and shipping as determined by digital PCR[J]. Clinical Biochemistry, 2013, 46(15):1561-5.
[5] Ryan W L, Fernando R M, Das K. BLOOD COLLECTION DEVICE FOR STABILIZING CELL-FREE PLASMA DNA:, WO 2013123030 A3[P]. 2013.

來源:北京百泰克生物技術有限公司
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